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熒光定量 PCR檢測服務

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 熒光定量 PCR檢測服務
一、 miRNA qPCR 技術服務項目
   1. 根據基因序列設計特異性的引物和熒光探針
   2. 抽提DNA/RNA,逆轉錄RT-PCR及cDNA擴增
   3. eal-TimePCR(熒光定量PCR),進行實驗結果分析  
   4.特色項目
     a、特殊物種(除人、大鼠及小鼠外)miRNA特異性引物設計(SYBR Green染料法)。本公司設計提供特異性的莖環引物,相較于傳統的Olig-dT引物,結果準確率更高。
     b、miRNA 差異性表達數據分析(包括提供t-test結果、實驗步驟、擴增曲線圖、溶解曲線圖、差異表達分析圖及原始數據)。
 熒光定量 PCR檢測服務
二、 miRNA qPCR 技術服務流程
   1. 樣品RNA準備
   提供樣品總RNA,也可提供組織、血液、細胞類樣品,需支付樣品的前期處理費用。
   2. RNA質量檢測
   紫外吸收測定法測定波長260nm和280nm的吸收值,判斷RNA樣品的濃度。
   3. 逆轉錄合成cDNA
   利用莖凸環引物逆轉錄合成cDNA鏈。
   4. 實時熒光定量PCR
   以合成的cDNA作為模板進行實時定量PCR擴增(每個樣品檢測三次,同時檢測每個樣品中U6 snRNA或5S rRNA含量作為內參,以校正上樣誤差)。
   5. 分析結果、提供實驗報告
   相對定量—分析相對表達參數,提供統計學分析,獲得相對表達差異;
定量—依據miRNA標準品制作標準曲線(每條曲線上至少設置5個數據點),以定量樣品中的待檢測miRNA;
分析實時定量PCR結果,提供實時定量PCR實驗數據和擴增曲線,融解曲線,柱狀圖。

 
三、miRNA qPCR技術服務樣品提供
   a. RNA樣品:取10µg總RNA,并提供RNA質量檢測圖。要求濃度在500ng/µl以上,體積在20µl以上,OD260/OD280的比值在1.8至2.0之間,電泳檢測28s的亮度約為18s的兩倍。-80℃貯存,干冰運輸。
   b. 組織樣品:請將200mg以上的組織樣本,并分裝為兩管。-80℃或者液氮貯存,干冰運輸。
   c. 血液樣品:請提供至少2mL血樣,并在2小時內處理完畢后加入Trizol。
     全血:用EDTA等抗凝劑處理后的樣本,按每200µl全血加入1ml Trizol的比率加入足量Trizol,渦旋搖勻,放入干冰或者-80℃箱保存,干冰運輸。
     血漿:用EDTA等抗凝劑處理后的樣本,4℃ 4000rpm離心5分鐘,上層為血漿樣本,按每200µl血漿樣本加入1ml Trizol的比率加入足量Trizol,渦旋搖勻,放入干冰或者-80℃冰箱保存,干冰運輸。
     血清:用非抗凝管收集血樣,靜置分離上層血清,按每200uL血清加入1ml Trizol的比率加入足量Trizol,渦旋搖勻,放入干冰或者-80℃冰箱保存,干冰運輸。
  d. 細胞樣品:
    貼壁細胞
   (1) 貼壁細胞培養或處理結束后,去除培養液;
   (2) 按每10 cm2 培養面積加1 mL Trizol試劑的比例加入Trizol試劑;搖勻,細胞接觸到Trizol而被充分消化;
   (3) 用1 ml槍頭反復吹打, 并將Trizol細胞懸液轉移至RNAase-free 的EP管中;
   (4) 放入干冰或-80℃冰箱中保存,干冰運輸。
   懸浮細胞
   (1) 懸浮細胞培養或處理結束后,離心去除培養液;
   (2) 保留的細胞用PBS 緩沖液快速洗一次,離心除去PBS 緩沖液;
   (3) 按照每5×106 個細胞加1 mL Trizol的比例加入Trizol試劑,渦旋振蕩使細胞充分懸??;
   (4) 放入干冰或-80℃冰箱中保存,干冰運輸。

 

 

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